一个“异端邪说”是如何一步步走到聚光灯下？
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撰文 | 黄宇翔
责编 | 叶水送
问细胞核内，谁主沉浮？
1962年，一篇发表在《美国国家科学院院刊》（pnas）的论文吸引了洛克菲勒大学教授vincent allfrey的注意力。
加州理工学院james bonner实验室的黄周汝吉从豌豆种子的胚轴纯化出dna、组蛋白以及rna聚合酶的粗提物，在试管中证明组蛋白的加入会显著降低dna的转录速率，从而得出组蛋白抑制rna合成的结论。[1]（黄周汝吉分离出的dna和组蛋白相对纯净，但rna聚合酶仅仅是粗提物。rna聚合酶的真正纯化是由生化学家robert roeder在1969完成的。）
allfrey围绕组蛋白对基因转录调节已经开展了多年的研究，同行新得出的证据令他感到十分振奋。
与此同时，伦敦癌症研究所（institute of cancer research）的英国科学家d.m.p. philips在长期研究小牛胸腺细胞组蛋白氨基酸组成的探索过程中，发现组蛋白的n端丰富的赖氨酸和精氨酸区域存在丰富的乙酰基团——一种由二碳单位组成的官能团修饰。[2]（allfrey精确地测算了每个核小体中乙酰基团的数目，甚至还在七十年代发现一种有机酸可以抑制去乙酰化的过程——这表明组蛋白的乙酰化修饰可能被精确调控，并且该平衡可能具有重要生物学意义。但受限于技术的限制，allfrey既不能证明组蛋白乙酰化修饰对于细胞有影响，也没能鉴定出添加、去除组蛋白乙酰化修饰的酶，这两项工作分别由后世的grunstein、allis、stuart schreiber等人接力完成。）
这不禁引发了allfrey的思考：这些乙酰基团的修饰可能具有哪些功能呢？
为了回答这个疑问，allfrey做了一个实验：他向小牛胸腺的核提取物中加入组蛋白，和他以前的观察一致，核提取物中rna转录的速率被显著抑制。但如果在提取组蛋白之前先用醋酸处理获得具有丰富乙酰化修饰的组蛋白 ，神奇的一幕发生了：乙酰化的组蛋白对核提取物的转录抑制效果轻微了许多。
“组蛋白修饰可能是一种激活/抑制rna合成的调节机制。”allfrey在发表这一实验的讨论部分谨慎地写道。[3]
allfrey基于化学原理进行分析，认为带有正电性的组蛋白之所以能抑制转录，很可能是因为结合了带有负电的dna分子，进而阻碍rna聚合酶对dna进行转录；而乙酰化基团的添加恰恰抵消了组蛋白上的正电荷，因此降低了组蛋白与dna的结合，从而消除了其对转录的抑制效果。
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在接下来的十几年里，allfrey和他的学生们试图为这一假说寻找具有生理学意义的证据：他们在马血、鼠肝和果蝇的唾液腺中都观察到了随组蛋白乙酰化程度升高dna转录速率升高的现象。[4-6]
但这些结果都只能说明组蛋白乙酰化与dna转录有很强的关联性，并不能从中推导出两者在因果上存在直接的相互作用。
因此，尽管allfrey苦苦坚持，不断增添着定量、描述性的证据，组蛋白乙酰化决定转录活性的观点在很长一段时间里在主流的分子生物学家眼中都只是个“异端邪说”。
七十年代，研究者通过电镜看到了组蛋白和dna的结合：dna就像一条项链一样缠绕在组蛋白上，roger kornberg将这一结构命名为“核小体”（nucleosome）。[9,10]
对于一名七十年代的生物学家来说，组蛋白仅仅是用来将dna缠绕浓缩、装进细胞核内的“集装箱”，没有太多值得去研究的意义。相比于染色质的结构，转录因子、rna聚合酶才是聚光灯下的真正主角。
对基因调控感兴趣的研究者们对于转录因子、rna聚合酶的研究趋之若鹜，而组蛋白的门前却无人问津。
七十年代末，几乎没有人注意到，一位名叫michael grunstein的年轻人悄无声息地踏入了组蛋白这片近乎荒芜的科学大陆。
在爱丁堡大学读博期间，grunstein在max birnstiel教授的指导下围绕核糖体基因功能展开研究，对基因的表达产生了浓厚兴趣，于是在博士毕业以后来到美国斯坦福大学，在laurence kedes实验室研究组蛋白的合成。
尽管组蛋白不被基因调控的研究者看好，但对于研究蛋白合成来说却是个不错的实验对象：kedes教授基于海胆卵在发育过程中会大量合成组蛋白的特性，通过研究不同亚型组蛋白mrna与蛋白质的对应关系，为中心法则提供了新的例证。[11]
1975年，grunstein受聘为加州大学洛杉矶分校（ucla）助理教授，目标通过海胆卵研究发育过程中不同亚型组蛋白各自的调控机制。[12]
随着研究的开展，海胆卵系统的不足逐渐凸显出来：海胆卵细胞中多达上百份的组蛋白编码基因拷贝固然为组蛋白的纯化提供了便利，但要想从机制上论证不同亚型组蛋白对细胞功能的影响，就显得捉襟见肘了。
grunstein面临着和allfrey相似的困境：如何才能从功能上研究组蛋白的作用呢？
1979年，一场由厄尔尼诺现象带来的风暴，彻底打乱了grunstein原本的研究计划。
气候变化导致太平洋海域的无机盐成分减少，近海的海胆数量因此骤降。巧妇难为无米之炊，他不得不转向其他的实验材料。[13]
1978年发表的一篇pnas论文吸引了他的注意力：康奈尔大学的gerald fink团队成功实现向酵母细胞转入外源的dna，并且能利用酵母细胞内部的同源重组机制实现基因的靶向敲除。[14]
与此同时，布兰迪斯大学的lynna hereford和弗吉尼亚大学的mitchell smith先后确定酵母细胞中4种常见组蛋白（h2a、h2b、h3和h4）各含有两个拷贝。[15]
有没有可能在酵母中敲除特定的组蛋白亚型的两条拷贝，观察对细胞生长、基因表达的影响呢？grunstein立刻报名参加了由gerald fink组织的酵母遗传学培训课程，从零开始学习酵母的实验操作方法。实验室的研究生john wallis和mary rykowski率先对组蛋白h2b进行分析，确认酵母中的两份h2b拷贝（h2b-1和h2b-2）序列同源、功能互补，任何一个存在都能支持酵母的正常生长。[16,17]
在接下来的几年里，grunstein的团队稳扎稳打，利用酵母遗传学手段对组蛋白的各个亚型逐个进行分析，终于由来自中国的留学生韩珉完成临门一脚，在敲除组蛋白h4后发现了rna转录的显著上调，一举回答了那个困扰allfrey几十年的悬案。[18]
组蛋白在体内的确会抑制基因的表达！并且韩珉等人还发现，组蛋白h4的n端富含赖氨酸的片段在各物种间都极为保守，选择性地敲除这一片段不会影响酵母的生长，但特定基因的表达调控会被破坏。[19]
这不正是allfrey在他模型中所设想的情景吗？
很遗憾，在科学界，对于一项重要的发现，并不是所有人都能立刻意识到其背后蕴藏的深刻意义。
真理有时掌握在少数人手中。
有时候，在天将降大任于少数人时，他们需要为自己的坚持隐忍多年，甚至还可能会为此丢掉饭碗。
david allis对此想必深有体会。
1988年，grunstein实验室发表选择性移除h4组蛋白n端片段的实验结果时，大多数人注意到的是对细胞生长没有影响，而非基因转录活性的升高。
移除了组蛋白中发生乙酰化的成分，酵母还能生长得欣欣向荣，不正说明组蛋白的乙酰化修饰对细胞功能没什么重要的影响吗？
贝勒医学院生化系的系主任salih wakil至少是这么想的。
因此他对于系里那名叫allis的年轻人对纯化组蛋白乙酰化酶的执着感到难以理解。
allis博士期间在印第安纳大学anthony mahowald实验室研究果蝇的发育问题。一个偶然的机会，让他与染色质和组蛋白结缘。
在一门研究生文献讨论课程上，allis被安排向同学们介绍近期pierre chambon教授利用电镜观察核小体结构的论文。在准备报告的过程中，他读到了allfrey围绕组蛋白乙酰化所提出的模型。如果能找到特定添加、去除组蛋白乙酰化的酶就好了。他心中暗暗感叹。
在文献讨论的过程中，allis激情澎湃地向老师同学们讲述组蛋白乙酰化修饰背后可能蕴藏的重要调控机制——但大家对此都无动于衷：在1975年，既没有证据支持组蛋白在体内对细胞功能必要，也没有多少人相信组蛋白的乙酰化修饰是经过严格调控的结果。[20]
但一旦认定染色质绝没有人们想象得那么简单，allis就下定决心，将揭示组蛋白对基因表达的调控作用看作是值得自己投入精力去探索的科学问题。
可当他在1978年博士毕业的时候，找了一圈下来却失望地发现：当时以果蝇为模式生物的实验室并没有兴趣去研究染色质的结构问题，而研究染色质、核小体的实验室又以他经验不足为理由将他拒之门外。
就在allis为找博后过程中所遇到的挫折感到郁闷的时候，anthony mahowald实验室一位名叫kathy karrer的博后师姐为他提供了一条建议。
“我听说罗彻斯特大学有一个实验室在用四膜虫研究组蛋白的功能，没准你可以去试试看。”
四膜虫？那是什么生物？他从没听说过有人用这种生物做研究，甚至连“四膜虫”（tetrahymena）这个单词也是头一回听说。
经过认真的调研，allis不仅搞清楚了四膜虫这个单词的拼写，而且了解到这种长有很多纤毛的单细胞真核生物确实十分有趣：四膜虫包含有两个细胞核，其中较大的称作“营养核”，能够合成大量四膜虫生活所需的蛋白质，而较小的称作“生殖核”，相对没那么活跃。
martin gorovsky团队在将四膜虫的两种核进行纯化后，发现其中的组蛋白组成存在着比较大的差异：其中转录活跃的营养核富含高度乙酰化的组蛋白，而转录相对沉默的生殖核则乙酰化程度较低。[21,22]
四膜虫的营养核中组蛋白乙酰化程度这么高，应该不乏乙酰化酶的存在吧？——allis在心中盘算着从四膜虫的营养核中纯化出组蛋白乙酰化酶的可行性。
来到罗彻斯特之后，allis通过二维电泳的方法对四膜虫营养核与生殖核中不同亚型的组蛋白进行鉴别，并且进一步确定了营养核中组蛋白丰富的乙酰化修饰，坚定了从营养核中分离组蛋白乙酰化酶的信念。[23-25]
1981年，allis来到位于休斯顿的贝勒医学院生化系，一心想要从四膜虫的营养核中分离出的乙酰化酶来。
七年的时光准瞬即逝，冷室中日夜的纯化工作让allis 从上百升四膜虫培养液中终于得到了在体外能具有乙酰化酶活的组分。但这些酶的含量对于基因克隆来说还是太少了，即使是在检测蛋白最灵敏的银染蛋白胶上，那个“理应就在那里”的组蛋白乙酰化酶依然杳无踪迹。
系主任salih wakil对他的耐心正逐步消退。
1988年，grunstein实验室新鲜出炉的论文终于成了压垮骆驼的最后一根稻草：尽管grunstein实际上揭示了组蛋白乙酰化对于转录的重要意义，可多数同行的目光依然停留在了h4组蛋白n端移除的酵母仍然可以健康生长的表型，认为组蛋白乙酰化不具有重要的生物学意义，对于allis孜孜不倦寻找组蛋白乙酰化酶的努力嗤之以鼻。
因此在终身教职的同行评议中，allis不幸挂掉了。
贝勒医学院已经容不下allis继续做他“没有前途”的乙酰化酶纯化研究了，他只得卷铺盖走人，投奔到雪城大学（syracuse university）的门下安身。
失去贝勒医学院的职位，并不能击垮allis的意志。不成功就成仁，他已经下定决心要与组蛋白乙酰化酶死磕到底。
james brownell的加入成了扭转乾坤的关键。
如何才能让含量极微的组蛋白乙酰化酶显露踪迹呢？
需要放大信号。
之所以他们能在反应中检测到组蛋白乙酰化酶的生化活性，关键还是在于一个组蛋白乙酰化酶能在几秒之内对成百上千的底物进行乙酰化修饰。
那在蛋白分离胶上，能否也实现一步信号的放大呢？
来自磷酸化修饰领域研究者的创意给brownell带来了灵感：在不久前一项关于磷酸化修饰的研究中，研究者在胶中加入了特定激酶的反应底物，然后在激酶提取物通过电泳被分离开后向其中加入32p同位素标记的atp分子，如此一来，尽管底物会布满整张凝胶，但只有在激酶集中的条带上磷酸化修饰才能发生，因此在洗掉atp之后，放射性显影下呈现出同位素信号的区域就是激酶集中的位置。[26]
显影照相记录的信号来自被磷酸化修饰的底物，但始作俑者却是激酶。磷酸化修饰和乙酰化修饰，本质上都是小的化学基团通过共价键连接在蛋白上。
brownell打算照葫芦画瓢，看看能不能通过这种方式在蛋白胶上定位到乙酰化酶。
这一次，200升四膜虫培养液中纯化出的蛋白没有让他们失望：放射性显影的照片上，55kda分子量位置出现了一道清晰的条带。
四膜虫的乙酰化酶分子量是55kda！[27]
有了分子量这个线索，brownell纯化出了更加浓缩的p55蛋白——第一个乙酰化酶的克隆指日可待了！
此时，罗彻斯特大学向allis抛出了橄榄枝，为他提供了更充足的科研资源。brownell学籍仍然保留在雪城，人随导师一起搬到罗彻斯特，而精神上则愈发接近克隆出乙酰化酶。
终于，第一个乙酰化酶基因的完整序列在brownell和allis面前降临。有趣的是，基于序列的同源性， brownell发现其实研究者此前已经克隆出过酵母中p55的同源基因gcn5。而gcn5作为转录因子对基因表达的激活作用完美印证了allfrey当年对于组蛋白乙酰化功能的预测。[28]
allis克隆乙酰化酶的论文发表一个月后，哈佛大学的化学生物学家stuart schreiber循着天然的去乙酰化酶抑制剂曲霉毒素（trapoxin）留下的线索，克隆出了第一个去乙酰化酶hd1，发现其在酵母中的同源基因正是转录抑制因子rpd3。[29]
此时，科学群体中的多数人才如梦方醒一般，终于意识到组蛋白乙酰化修饰的重要意义。
以组蛋白修饰为代表的表观遗传学研究爆发出耀眼的光芒，吸引着那些当初嘲笑过allis的人们纷纷跟风加入寻宝大队。
表观遗传研究，一跃成了最为热门的领域。
随着越来越多的研究者加入表观遗传研究的队伍，人们很快发现，组蛋白的异常修饰在癌症发生过程中扮演着至关重要的作用，靶向组蛋白乙酰化修饰的药物如今也纷纷已经获批上市造福病人。[30]
michael grunstein（左），david allis（右）
2018年，grunstein和allis凭借他们对组蛋白研究开创性的贡献获得了拉斯克奖。（另一位应当被铭记的科学家是alan wolffe（1959-2001），他在九十年代染色质研究被看作冷门时坚持推进染色质领域的研究，并且努力呼吁人们重视染色质在转录调控中的功能。另一位表观遗传领域的领军科学家danny reinberg，是在allis开创出一片表观遗传天地之后才一骑当先，从对转录因子的痴迷转向对组蛋白的偏爱，做出了一系列非常精彩的工作，笑傲群雄。）
随着领域的发展，人们逐渐发现在组蛋白的乙酰化酶、去乙酰化酶不仅仅局限于细胞核内。在细胞质基质中，也能观察到可观的参与乙酰化修饰分子机器的存在。[31-33]
乙酰化在细胞中有没有可能是一种非常普遍存在的化学修饰呢？剑桥大学的tony kouzarides教授在2000年撰写的一篇综述中提出了这样一个问题。[34]
但组蛋白乙酰化修饰这片已经发掘出的金矿实在太热门了，急于在其中捞金的多数人暂时对此无暇顾及。
这时三个转录调控领域的门外汉忽然闯了进来，绕开拥挤的人群，从众人忽视的角落中悄悄取下了最为珍贵的一块宝石。
这三位昔日曾为同窗，却又各怀绝技：一位精通信号通路，一位成名于细胞周期调控、不久前刚刚在蛋白降解领域闯出了名堂，而另一位则是专长微生物遗传学方法的高手。
细胞核外，原来姹紫嫣红开遍
2004年初，看着学生展示的免疫印迹数据，管坤良吃惊地说不出话来。
用靶向乙酰化基团的抗体与细胞的不同组分进行孵育后，细胞核内检测到的乙酰化修饰信号很强。这在情理之中，因为细胞核里有组蛋白，组蛋白上有丰富的乙酰化修饰。但在细胞质基质的组分中，乙酰化修饰的信号也不弱。
这就奇怪了，因为正常情况下细胞核内的组蛋白的都不敢越雷池一步。也许信号来自于微管蛋白？——微管蛋白中存在乙酰化修饰，但功能一直不清。或许还有可能是其他未知的细胞质基质蛋白存在乙酰化修饰？
这个问题和他目前聚焦的信号通路课题关系不大，因此管坤良没有过分纠结于这个意外的观察。但由这张胶图引发的问题却留在了他的脑子里。
两年的时间过去了，管坤良和同一届考上cuseba项目的老同学熊跃决定携手回国，兼职在复旦建立一个实验室为国内培养出更多的科研人才。
两个人约定，要在新地方争取开创出一片新领域来，各自美国实验室正在开展的课题都绝不延伸到复旦mcb实验室来。
熊跃和管坤良
两个人头脑风暴，希望能想出一个能发挥出各自专长的科学问题。想跳出思维的框架来，可没那么容易。
就在两个人思维双双陷入停滞之时，两年前的那张免疫印迹照片忽然间跳入了管坤良的脑海中。
此时，复旦大学刚刚建立了独立的蛋白质组学质谱平台，他们心想不如碰碰运气，看看能不能通过组学的手段找出一两个发生乙酰化修饰的新靶点来吧！
质谱的实验结果让两人吃了一惊。
每一个参与代谢反应的酶上，几乎都能检测到乙酰化修饰的信号。究竟是真正的科学突破，还是检测方法带来的假象？
从质谱的数据中展现的蛋白清单中，两人挑了几个进行检验。看来信号是真的，而且乙酰化修饰的有无真的会影响蛋白的活性。
老同学赵国屏听说了他们的发现，利用遗传学工具进行检验。敲掉沙门氏菌的乙酰化酶，细菌的代谢竟会大幅改变。看来乙酰化修饰的功能被前人大大低估了。
整理着数据，正准备投稿，忽然发现一篇新鲜出炉的论文，也把乙酰化修饰的广泛存在报道。[35,36]难道被惨遭抢发？不免倒吸一口凉气。细看同行的数据，才算松下一口长气。他们的论文发现了更多的靶点，而且做了更充分的验证。
经过半年审稿，总算成功发表。[37,38] 2010年管坤良、熊跃和赵国屏联手发表的两篇论文，向人们揭示了细胞中乙酰化修饰存在的广泛性，为十年以前tony kouzarides提出的问题给出了肯定的回答。
乙酰化修饰正如磷酸化一样，是细胞中一种广泛存在的共价修饰。在接下来的十年时间里，以复旦肿瘤医院雷群英团队为代表的许多研究，报道了更多乙酰化修饰调节代谢酶活性和稳定性例子，进一步确立了非核蛋白乙酰化的意义。[39-44]相关研究发表在cancer cell、molecular cel、j.clin.invest.等杂志上。雷群英也曾多次受冷泉港、美国癌症年会等国内外的会议邀请作报告，推动了肿瘤代谢学科发展。
发现这些新的修饰、新的调节机制有什么用呢？
我们来举雷群英团队发现的其中一个例子来看看：癌细胞比人体正常的组织细胞更耐酸，并且能通过积累、分泌乳酸来抑制组织细胞的生长。此前人们发现胰腺癌细胞之所以能产生更多的乳酸，和一个名为乳酸脱氢酶表达量升高密不可分，但对于究竟为什么胰腺癌细胞会产生这么多的乳酸脱氢酶一直都是个谜团。
雷群英团队在2013年发现，乳酸脱氢酶上第五个氨基酸（记作k5）的乙酰化修饰很可能是决定乳酸脱氢酶在细胞内稳定性的重要调节机制——乳酸脱氢酶一旦在k5位置被添加了乙酰基团，就仿佛得到了一张“免死金牌”，变得不那么容易被细胞降解掉了，因此乳酸脱氢酶k5位点的乙酰化修饰有可能是胰腺癌细胞早期癌变过程中的一个主要特点。[39]
如果我们能在体检的过程中检查乳酸脱氢酶k5位点的乙酰化修饰，是否可能在胰腺癌发生癌变的早期提前“感知到”潜在的危险，进而通过预防和治疗避免病情的恶化呢？这便是这一发现潜在的临床转化价值。
为什么早期乙酰化的研究者会将精力集中在组蛋白中，而没能发现乙酰化修饰更为广泛的存在呢？检测手段有局限。allfrey在60年代研究乙酰化修饰时，手中并没有能靶向乙酰集团的抗体——他需要依靠整合进组蛋白的同位素来推测组蛋白是否发生了乙酰化修饰；此外，也离不开管坤良勤于思考：也许在他之前也有人观察到了细胞质基质中的乙酰化修饰信号，但没有深究，于是错失了打开一片新领域的机会。
熊跃和管坤良能在很短时间内揭示这一重要现象，另一个不容忽视的因素就是质谱技术的发展：得力于物理学和化学的发展，如今的质谱仪器能做到“明察秋毫”，也由此揭示出细胞中许多前人未曾发现的新发现。
参考文献：
制版编辑 | morgan
