最后的战役：六年坚持，终于修成正果
“有些时候觉得自己应该坚持下去。假如是在距离成功还差一步之遥的时候功亏一篑了，可能以后再面临类似的困难时，就再也没有战胜它的信心了。”
撰文 | 黄宇翔
编辑 | 金庄维
绝望（2017.1-2018.4）
让我们简单回顾一下，截至2016年年底，许悦的科学故事包含了哪些内容：
首先，sebx是细菌的一个具有adp核糖转移酶活性的蛋白，可以抑制宿主细胞的异源自噬通路激活；
其次，宿主细胞的v-atpase能招募atg16l1，进而触发异源自噬的通路。
以上的第一句话是说，许悦发现了一个全新的细菌效应分子，这个效应分子进到细胞里会搞破坏，导致宿主细胞不能再有效地将入侵者标记为“有害垃圾”进行清除；
第二句话是说，许悦揭示了宿主细胞对付“有害垃圾”的一套全新通路。
这两个发现，假如单独整理出来，其实已经足够在一流的学术期刊上发出两篇漂亮的文章了。
不过邵峰团队素来以追求完美著称，一项研究不做到尽善尽美，绝不会轻易发表。而在许悦的工作中，整个逻辑链条的扣合，还差最后一枚关键的拼图。
相信聪明的读者们也和当时的许悦一样，已经看出整个故事所欠缺那枚拼图了：sebx是如何发挥酶活性，抑制宿主细胞的异源自噬通路的呢？也就是说，许悦那个时候还不知道，细菌的效应分子sebx究竟是怎么在细胞内四处搞破坏的呢？
只有找出细胞内sebx确切的底物，才能将整个故事讲圆。
于是，在2017年的1月，许悦踏上了寻找sebx体内底物的征途。
adp-核糖转移酶对于邵峰实验室而言，是一个从未涉足过的领域。这意味着，一切都需要自己从头摸索。
她首先刷遍了关于adp-核糖转移酶的研究文献，并且搜集梳理出几乎所有与之相关的实验方法。在邵老师的支持下，她从公司订购试剂、给相关实验室写邮件借实验材料，尝试了多种检测细胞内adp-核糖转移酶底物的方法。
许悦采用的各种检测方法比较一致的基本思路是，将adp-核糖基团带上特殊的标记（例如同位素、生物素），使得被adp-核糖基修饰过后的蛋白可以被常用的生物学手段检测到。
经过辛苦的摸索试错，这些检测方法在许悦手上，阳性对照和阴性对照结果终于都已经能做到近乎完美了。
但在细胞内，她使尽浑身解数，仍无法检验到sebx的底物。
到了2017年9月，已经进入博士第六个年头的许悦开始感到了毕业的压力。她的科学故事截止到此其实已经足够精彩，即使没有找出sebx的底物，也足够将这个工作发在不错的杂志上了。
但凤非梧桐不栖，固执的许悦相信这一发现的重要性，不甘心就此放弃。
“有些时候觉得自己应该坚持下去。假如是在距离成功还差一步之遥的时候功亏一篑了，可能以后再面临类似的困难时，就再也没有战胜它的信心了。”许悦如此回忆那段煎熬的时光。
但一次又一次的阴性结果，意志再坚强的人也会陷入深深的自我怀疑当中。
“我有时候会很害怕，担心阴性的结果背后不是检测手段的局限，而是自己真的想错了，”许悦解释说，“我检测的方法都是sebx催化蛋白质的adp-核糖基修饰，但如果细胞中不是这样的呢？毕竟此前有研究报道adp-核糖转移酶是可以将adp-核糖与非蛋白小分子共价连接，比如在表观遗传学领域大家都比较熟知的sirt2，它催化组蛋白去乙酰化，将adp-核糖基团与乙酰基相连。如果sebx催化的结果是对非氨基酸类的小分子的修饰，那我的实验手段就是错误的。一次次的阴性结果让我担心自己真的是在南辕北辙。”
许悦的顾虑是，她所有的实验方法都基于sebx修饰的底物是蛋白质这一基本假设。但假如大自然跟她开了个玩笑，sebx在细胞内的实际底物是非蛋白小分子，那么她就是再坚持下去也是不可能做出结果的。
在2017年年底一次向邵老师的讨论工作时，许悦再一次呈现了拥有完美对照组sebx底物检测的阴性结果，她表现出深深的焦虑。这时候，邵老师安慰她。
“我们已经把能想到的方法都试过了，也许因为现有技术的局限性，这可能不是一个现在能回答的科学问题。”邵老师低沉的嗓音顿了顿，“我不能替你做决定你应该什么时候选择放弃，也许你应该设定一个deadline。”
震惊，沮丧，绝望，无助。在休息区的沙发上，她内心中积累的压力在此刻被一齐释放了出来。
这次崩溃过后，许悦又尝试了几种方法，依然都只有阴性结果。已经进入到博士第六年的许悦，在寻找sebx底物的同时也开始着手整理实验数据、撰写文章。
2018年4月10日，邵老师认真修改后将这份带着些许遗憾的文章投到了《细胞》杂志。
一个月后，他们接到了《细胞》杂志编辑的拒稿邮件。
三个审稿人中，审稿人1比较认可此项研究，但也看出了文章在逻辑上没有扣上的漏洞，希望回答sebx是如何抑制异源自噬的；
另外两位审稿人则对于许悦提出的新模型非常抵触，给出了非常负面的评价意见。
可能由于先入为主的观念的影响，后两位审稿人对于文章看得并不是很细致，一位审稿人甚至弄混了文章中在细菌上做的转座子遗传筛选和在真核细胞上做的crispr遗传筛选。
馈赠（2018.4-2018.5）
期望落空，总在众望所归之处；
期望常现，总在心灰意冷之时。
《终成眷属》 威廉·莎士比亚（1564-1616）
但就在接到《细胞》杂志拒稿的第二天，sds-page蛋白胶上的一条17kda的条带，让许悦精神大振。而这个实验结果的来源，则要追溯到将近一年前在北生所的一场学术报告。
2017年6月，北生所的董梦秋老师邀请瑞士苏黎世大学的michael hottiger教授在所内作报告，报告的内容是用蛋白质组学方法研究真核细胞中的adp-核糖转移酶。
在报告中，hottiger教授提及他实验室开发出了能高效结合adp-核糖的改造蛋白af1521以及实验室自制的抗体。
邵老师给hottiger教授写邮件索要试剂，起初hottiger教授还有几分顾虑（文章至今没有发表），但邵老师详细介绍了课题与实验目的后，他非常慷慨地提供了辛苦改造的表达af1521的质粒以及识别adp-核糖的抗体。
但由于一些曲折并且不可控的因素，在2018年4月底，许悦才正式收到hottiger教授的提供的珍贵质粒。她利用改造后的af1521去富集细胞中adp-核糖修饰的蛋白，然后用hottiger教授提供的抗体进行蛋白质印迹检测。当拿到显影的结果后她立刻喜上眉梢：相比对照组，异源自噬通路抑制的实验组在分子量为17kda附近多出了一条明显的条带。这意味着运用hottiger教授提供的试剂，那个许悦苦苦寻找而不得的细胞内sebx修饰底物千呼万唤始出来了。
终于获得了能捕捉sebx修饰底物的工具，就距离把这个底物找出来不远了！
图6. 17kda的条带。发现sebx作用底物的原始数据：使用michael hottiger赠送的试剂，许悦发现细菌自噬抑制组相比对照组在分子量17kda附近有一个条带，后续的化学分析表明这正是被sebx修饰的靶蛋白atp6v0c。
不过在技术上，想要精确地鉴定出adp-核糖修饰的位点，在质谱学方面还存在一些技术性的困难。
此时，质谱学科班出身的程森加入了这个团队。
强援（2018.5-2018.12）
程森的合作参与要从2017年10月的一场虚惊说起。
许悦在邵峰老师实验室培养了非常良好的文献习惯，会定期在网络上检索和自己课题相关的最新进展。比如说，她在谷歌学术网站就设置了“异源自噬”等关键词，以防错过了领域内重要的最新进展。
2017年的十月，她偶然看到了北京大学化学学院刘小云课题组在一篇质谱学专业期刊发表的研究，这项研究通过对另一个沙门氏菌株系所分泌出的蛋白进行组学分析，鉴定出了一个编号为stm1239的全新效应分子，并将其命名为sopf，意思是沙门氏菌中发现的编号为f的效应分子[7]。
许悦在ncbi上搜索了sopf的基因序列——刘小云团队鉴定出的sopf，与她苦心经营钻研数年的sebx完完全全是同一个基因。
2017年10月，正是她苦苦寻找sebx底物而不得，压力最沉重的时期。
邵老师建议许悦在第一时间向刘小云老师发送邮件，解释自己在三年半以前独立鉴定出了这个基因在异源自噬通路中的作用，并来到北大向刘小云老师和那篇文章的第一作者介绍了自己的研究内容以及存在的困境。
程森就是那篇为sopf命名的质谱学研究的第一作者，2014年入学北京大学前沿交叉科学学院的一名博士研究生。
因此，当许悦在2018年5月看到了那条17kda条带之后，邵老师主动联系刘老师，希望在质谱方面富有经验的程森可以共同参与到这一课题中。
程森首先将整条泳道的条带切下，制备出做第一次质谱实验的样品——初步的实验结果表明，adp-核糖修饰发生在v-atpase复合物中atp6v0c亚基上。
带有adp-核糖修饰的atp6v0c，就是许悦在蛋白质印迹检测中观察到的17kda片段——其中，atp6v0c分子量约为16 kda，adp-核糖分子量为541da。
可是，如何才能找到sopf是在哪个位点对atp6v0c进行修饰的呢？
一般的接受生物学训练的研究者，只会将样品送到仪器中心，按照标准流程检测，如果检测结果显示失败，只能无奈地发出一声鞭长莫及的叹息。
但当时，程森在刘小云实验室已经积累了四年和质谱仪打交道的经验，对质谱仪的各种参数都很熟悉，因此能根据自己样品的特性调节质谱仪检测的参数。经过几次摸索，程森首先将adp-核糖的修饰位点缩小到了一串“gtaqqpr”七肽序列上，进而再接再厉，推断出修饰发生在atp6v0c第124个位点的谷氨酰胺上。
许悦立刻对海拉细胞atp6v0c基因第124号位的谷氨酰胺做了点突变，最终证明该位点对于介导异源自噬通路的必要作用。
最后一块拼图终于完美插入进来，现在整个故事的逻辑无懈可击。
2018年12月20日，许悦顺利完成了博士毕业答辩。
就在同一天，邵峰老师将修改好的文章重新投到了《细胞》杂志。
图7. 鉴定adp核糖修饰位点。程森通过质谱学手段，检测出sebx对atp6v0c的adp核糖修饰发生于第124位的谷氨酰胺。
尾声（2018.12-2019.7）
我们实际上是打开了两个黑匣子，一个是发现并把一个功能未知的细菌效应蛋白的作用机制搞清楚了，另一个是把细菌诱导激活的异源自噬通路阐明了，而打开第一个黑匣子正是为打开第二个黑匣子提供了可能（这也是为什么前人未能打开第二个黑匣子的原因），这样的研究路径和思路是我自己觉得最酷和最有吸引力的地方。 邵峰
这一次，《细胞》杂志的编辑对许悦博士的研究心悦诚服，除了将修改的文章重新发给了此前的三位审稿人，又邀请了第四位审稿人对这篇文章进行评价。
此前提出在细菌效应分子和宿主细胞互作方面存在漏洞的审稿人1在看到新增加的证据后，完全被说服，给出了非常正面的反馈意见；
审稿人2和审稿人3对于文章提出的新模型提出了他们后续的问题；
审稿人4给出了很积极的反馈。
在与审稿人几次交锋，根据审稿人要求完成了相应需要补做的实验之后，这项工作最终在2019年6月3日被《细胞》杂志正式接收，2019年7月18日正式在线发表。许悦博士为文章的第一作者，周平博士为第二作者，程森博士为第三作者，邵峰老师为通讯作者，丁璟珒博士、刘小云博士和michael hottiger教授都位列在作者之席[8]。
图8. 几个值得纪念的时间点：
2018年4月10日，首次向《细胞》投稿，一个月后收到拒信；
2018年12月20日，许悦博士答辩，再次将文章送审；
2019年6月3日，文章被《细胞》正式接收；
2019年7月18日，文章正式在线发表。
由于刘小云课题组工作发表在前，因此邵峰老师团队放弃了原先sebx的名字，沿袭了此前报道中sopf的命名。
许悦博士目前以短期博后的身份继续留在邵峰老师实验室从事她热爱的科研工作，主要在整理实验数据，准备着sopf故事相关的第二篇文章的投稿。
谈及这项工作，许悦无不感慨：“读博之前已做好经受磨难的准备，但当困在其中久了之后，焦虑与不自信就慢慢占据了内心。现在回想起来，邵老师的指导、整个团队的合作与朋友们的关心最终帮助我度过了重重难关。邵老师说过的几句话还时常想起。
‘你现在最大的问题是没有自信。’课题处于探索性阶段时，每次实验都抱有一点期望，但得到的往往都是阴性结果，邵老师对我说的这句话瞬间就戳中了我的内心。这个过程中自信在消减，慢慢就丢失了思考与实验的动力，最后很有可能就在不断否定中放弃。
‘专注，是我们拥有最强大的武器。’现在的社会中，太多事情会分散我们的注意。每天打开手机，各种资讯稀释着我们的时间。唯有专注，才能比别人拥有更多的时间来解决真正有价值的问题。
‘要保持独立思考的能力。’这一点相信是每个科研工作者都认同的事情，要做原创性的发现，不能人云亦云，勇于挑战权威。如果当初邵老师接受异源自噬的主流观点，那这个课题也就不复存在了。
这些品质都是我在邵老师身上学习到的最有价值的财富，与大家共勉。”
最后再聊聊这个故事里的其他几位主人公现在都在做什么吧。
周平博士在帮助许悦完成寻找异源自噬的crispr筛选之后，随后又接着利用流式分选与crispr技术做了另一个筛选——找到adp-heptose激活nf-κb通路的必需基因。有了之前积累的丰富经验之后，这次筛选简直就是小菜一碟。只做了一次实验，就成功筛选到alpk1与tifa两个关键基因。随后他又证明alpk1是adp-heptose的受体，磷酸化tifa激活nf-κb，这项工作在2018年顺利发表在《自然》杂志上[9]。周平即将结束在邵峰团队长达7年的博后生涯，将在年底入职厦门大学生命科学学院，建立自己独立的实验室。
丁璟珒博士在2018年正式被提升为中科院生物物理所正研究员，目前继续从事着对病原细菌感染的前沿研究；
至于整个故事背后的大boss，北生所的邵峰老师，哈哈，就让我们和“赛先生”一起，期待在未来从他实验室出产更多精彩的研究工作吧。
致谢：
感谢许悦博士、周平博士接受“赛先生”的采访，并对稿子中与事实偏离的错误予以指正。
感谢邵峰老师百忙之中抽出时间对稿件真实性进行审定。
感谢屠鑫明先生、刘时昱先生、冯莎莎女士、刘斯敏先生、苏嘉昱先生、张任子墨先生、董明泽先生、郑璞先生、范家豪先生与笔者所展开的极具启发性的讨论。
参考资料
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[3] wild, p. et al. phosphorylation of the autophagy receptor optineurin restricts salmonella growth. science 333, 228–233 (2011).
[4] cong, l., ran, f. a., cox, d., lin, s., barretto, r., habib, n., ... & zhang, f. (2013). multiplex genome engineering using crispr/cas systems. science, 339(6121), 819-823.
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[7] cheng, s., wang, l., liu, q., qi, l., yu, k., wang, z., ... & li, m. (2017). identification of a novel salmonella type iii effector by quantitative secretome profiling. molecular & cellular proteomics, 16(12), 2219-2228.
[8] xu, y., zhou, p., cheng, sen., … & shao, f. (2019) a bacterial effector reveals the v-atpase-atg16l1 axis that initiates xenophagy. cell
[9] zhou, p., she, y., dong, n., li, p., he, h., borio, a., ... & shao, f. (2018). alpha-kinase 1 is a cytosolic innate immune receptor for bacterial adp-heptose. nature, 561(7721), 122.
