马兜铃酸肾病：研究及启示
导读
自从1990年代确认马兜铃酸具肾毒性以来，围绕马兜铃酸造成肾损害的病理机制以及它进入人体的致病途径，展开了不少研究。而马兜铃酸成分见于传统医药的一些草药当中，未免引起有关如何使用草药药材及成药的争论。介绍相关研究成果，不仅对防治肾病，而且对促进公共卫生及中西医交流，均会产生积极影响。
撰文 | 薛寿征（复旦大学上海医学院）、曾广先（南京医科大学附属职业病院）
以比利时减肥药中误加广防己而引发集体肾衰的事故为缘起，马兜铃酸致肾病的危险性日益得到人们关注。马兜铃酸为草药肾病（chn）、巴尔干地方性肾病（ben）、上尿路细胞癌（uuc）及肾细胞癌（renal cell carcinoma, rcc）等的病原。此物质被人体摄入后，与嘌呤共价结合，形成以a:t/t:a（腺嘌呤:胸腺嘧啶/胸腺嘧啶:腺嘌呤）碱基突变为主的马兜铃内酰胺-dna加合物（al-dna adduct），能避过切除修复而终生潜隐，引发肾衰及尿路癌症。目前把相关的疾病统一命名为马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy, aan）。
尤其在中草药使用大国的中国，马兜铃酸之慢性危害更是一个敏感和引起争议的问题。对这种危害的研究，涉及毒理、分子病理及表观遗传等领域。随着对马兜铃酸致病途径及机理的认识深入，人们可以更加合理地使用中草药，同时有效防治aan。
布鲁塞尔肾病事件和巴尔干地方性肾病
1992年，比利时布鲁塞尔有一批中年妇女罹患肾功能减退性肾病，被称为草药肾病（chinese herbs nephropathy, chn）。查询得知，她们都服用过同一诊所处方的相同减肥胶囊。1975—1990年间，这种胶囊效果良好，1990年5月起被加入防己和厚朴。1992年出现9名病人，很快进入肾衰[10]。化学分析发现，减肥药中的粉防己（stephenia tetranda）为马兜铃防己（aristolochia fangchi）所取代。12批粉料中有10批含马兜铃酸，平均浓度0.609毫克/克。累计剂量147毫克即发病，摄入剂量与病情进展速度成比例。可以排除胶囊中的其他成分参与作用，仅马兜铃防己是唯一危险因素[12]。1992年年底，比利时撤除了防己上市。明确chn的病原是马兜铃酸（aristolochic acid, aa）[12]。到1998年，在被诊治的128个病例中，70%已发展到肾病终末期(end stage renal disease, esrd) [13-15]。
在发生布鲁塞尔肾病事件的当时，科桑（j. p. cosyns）等人由患者肾脏标本的病理检查结果，机敏地觉察到，此病临床表现与病理变化跟巴尔干地方性肾病(balkan endemic nephropathy, ben) 相同[11]。ben是1950年代在多瑙河流域发现的一种农村家庭聚集、缓慢发展的肾病，临床无特异表现，常潜隐数年至数十年，渐有软弱无力、轻度腰背痛及皮肤苍白。至50~60岁后，有贫血及肾功能衰退、蛋白尿和特殊的α1微球蛋白尿。病理特征是肾小管萎缩消失，寡细胞性间质纤维化，肾脏萎缩变小。一般经过15~20年，发展到肾功能衰竭，约半数合并上尿路癌症（肾盂和输尿管癌），大多数患者死于并发的癌症[16-18]。
对ben曾广探病原，但长期未获确证。到1994年，科桑见到chn的临床和病理表现与ben相同，才注意到马兜铃酸，并很快取得了证据。chn及ben患者都有一半左右并发上尿路细胞癌（upper urothelial cancer, uuc），这为马兜铃酸致病提供了另一重要证据。ben患者都有过马兜铃酸暴露；特别是在患者的肾脏或癌标本中，都检测到了al-dna加合物，并带有特征性的a:t/t:a碱基突变[17-20]。
围绕ben病区，有过多次国际学术会议，制订了查诊治防的共识性文件[21]。ben为长期食用含小剂量马兜铃酸的食品而患病，这值得“保健养生”型的含马兜铃酸中草药使用者予以关注。中国仍有24种上市药材和47种上市成药，含小剂量马兜铃酸。相关的资料对于国内监测马兜铃酸所致的不良反应以及aan，具有参考价值。
马兜铃酸肾病[15]的普遍罹患情况
继布鲁塞尔肾病事件之后，在西班牙、法国、英国、德国、美国、澳大利亚、中国、日本、孟加拉、韩国都有aan的报告。
患者均处于中年，经血液分析发现肾功能减退,典型的表现有中度高血压、血清肌酐增高、严重贫血。可以更精确地从尿中检出5种来自肾小管的低分子蛋白质、尿中性内肽酶（nep）、肾近曲小管刷状边缘的94kd胞外酶，这些反映尚残存肾曲小管细胞的尖端部分，指示肾病的严重程度。中等程度的患者尿中nep显著减少，而到后阶段几乎测不到，说明肾曲小管已丧失。从宏观上看，肾脏萎缩，边缘不齐；有广泛寡细胞的间质纤维化，肾小管萎缩和缺失，肾小球减少，后期有毛细血管塌陷和基底膜褶皱。在肾活检材料中可看见炎性浸润，提示有免疫变化[15,17,19,20,31,51]。
中国台湾是aan重灾区，透析和肾移植率均占世界高位，支出也占保健经费前列。最早的报告是1995—1998年间有12例减肥草药引起的chn[22]。2003年禁用了4种。据1997—2002年间对20万人保健记录的分析，一半人用过中草药，39%摄入过含马兜铃酸（或疑似）的草药[23]。5年内有新发终末肾病25 843例。再以174 701为对照，采用病例对照方法,算出累计服用60克关木通为增加发病的阈限，60~100克者的相对危险度为1.6(即发病增加60%)；200克以上为2.1(发病增加110%)[24,25]。另外，应用循证医学(evidence based medicine)做临床试验，对一些古方剂的安全性与不良作用进行观察，其中包括酸枣仁汤、独活济生汤、健胃逍遥散、滋补地黄丸和香砂六君子汤等。整个回顾性队列在1997—2002年间共有199 843人，除有终末肾病25 843人外，还有慢性肾病2 343人[26-28]。
北京大学第一医院在2011年有300个病例的报道[29]：急性型13例，服用马兜铃酸时间中位数为14天(1~120天)，累积剂量中位数1.04克(25毫克~16.3克)。起始服用到发病的中位数40天(1~210天)，69.2%的病人入院时仍在服用。慢性型280人，服用时间中位数为5年(6天~41年)，累积剂量中位数1.01克(0.02~3.96克)。起始到发病的中位数7年(3个月~42年)，45.7%的病人入院时仍在服用马兜铃[29]，而事实上，马兜铃、青木香、关木通在2003年就已禁用，只是公众对此未予以足够重视。该报道还分析了马兜铃酸在血液中的含量。一次摄入后，马兜铃酸与血液中蛋白质结合，1.5年左右才逐渐消失。卡巴特（g. c. kabat）认为，al-dna加合物可终生存留于体内[4,9]。
马兜铃酸与肿瘤
1994年科桑发现，从开始服用马兜铃酸到aan患者发生癌变，仅需2年时间[11]。2000年报道了39例aan病人的切除标本的病理检查，有18例癌肿，另有19例癌前期变化，范围较广泛而多中心；仅2例的细胞形态正常[30,32]。
台湾赖敏南等人对2001—2002两年间新诊断的4 594名uuc患者和174 701名对照者的资料进行了分析。结果表明，累计服用木通超过60克（折合马兜铃酸155毫克），患uuc的相对危险度（or）为1.6（1.3~2.1）；超过200克则为2.1（1.3~3.4）。防己超过100克（折合马兜铃酸204毫克），相对危险度3.1（2.1~4.5）；细辛超过300克，则为2.4（1.6~3.8）[26,35,37]。
温州第一医院2004—2013年间收治102例马兜铃酸肾衰病人，42例(41.2%)并发癌症，其中39例(38.2%)为泌尿系癌，占全部癌的92.9%。癌症与马兜铃酸摄入剂量相关[33]。上海肿瘤医院收治的上尿路癌患者中，85%以上查出有al-dna加合物及a:t/t:a突变标记[9]。另据研究者对中国及巴尔干地区一些文献资料的分析，在摄入过马兜铃酸的8 909人中，罹患上尿路癌的患者为480例，分组相对危险度是2.0~49.00，荟萃分析（meta-analysis）的集合危险度是5.97(2.78~12.84)，即摄入者患癌约6倍于常人[25]。又有研究者在肝癌、膀胱癌、肾透明细胞癌等的标本中，检出马兜铃酸或其代谢衍生物的较高阳性指标。
马兜铃酸和马兜铃药材被国际肿瘤研究机构认定为人的肯定致癌物。欧洲药物评审组织（emea）在2000年，美国食品药品监督管理局（fda）在2001年，国际癌症研究机构（iarc）在2002、2012年[38]，美国国家毒理学项目（ntp）在2011年[39]等，都把马兜铃酸列为人致癌物[40-44]。中国国家食品药品监督管理总局（sfda）2017年11月2日公告，2003年已禁用关木通、广防己、青木香及细辛药材的地上部分，而在药品名单中仍保留了含有小量马兜铃酸的24种药材与47种成药。
马兜铃酸的来源
马兜铃酸来自于马兜铃科植物。该科共有500多种，其中99种入药，亚洲占一半，用于治疗遍及各科的疾病[1]。2016年用色质联营代谢组学方法分析，从43种药用的马兜铃科植物中得到28个马兜铃酸衍生物。以最高含量计，马兜铃酸ⅰ（aaⅰ）为2.467毫克/克，马兜铃酸ⅱ（aaⅱ）为2.557 毫克/克[2]。
马兜铃酸ⅰ（aaⅰ，左）和马兜铃酸ⅱ（aaⅱ，右）
在历史上，明朝御医刘纯列出的911味慢毒药材中，有木通、青木香、天仙藤和铁线莲等15种马兜铃科药材。可惜他的发现未得到广泛流传[5]。1964年吴松寒报告了2例肾衰[3]，被认为是偶发的[4]。1969年，伊维奇（m. ivic）指出ben疫区麦田中盛长铁线莲马兜铃（aristolochia clematitis）, 其种子混入麦子和面粉，烤成面包被食用。他的发现亦未受重视。直至1994年，才由科桑确立了马兜铃酸致病作用。
2005年赫拉涅茨（t. hranjec）到克罗地亚进行现场调查，再次证实ben由铁线莲马兜铃引起。他取样品回美国测出马兜铃酸含量0.65%，估算10 000粒麦子中如混有10粒铁线莲种子，长期食用即可致病[18]。
2013年，帕夫洛维奇（n. m. pavlovic）揭示了马兜铃酸进入人体的另一条途径：铁线莲马兜铃种子或植株散落于土壤中，分解出马兜铃酸，蓄积在泥土里，被后茬作物所吸收和富集。玉米、黄瓜的根系均可吸收马兜铃酸，构成天然的经食物链的毒物污染[41]。相继在ben流行区克特列斯（ketles）村取得泥土和栽种的玉米与小麦送到香港科技大学检测，均查出马兜铃酸。麦粒及泥土中aaⅰ含量为（都是14样品的均数，单位为纳克/克）：麦粒91.9，泥土86.6，富集系数1.08；aaⅱ含量：麦粒41.0，泥土25.5，富集系数1.75。富集系数大于1.00，说明在麦粒中比在泥土高。这是疫区泥土和食用作物污染马兜铃酸的直接证据，有力地支持了食物中毒途径[42]。后来又通过检测证明，在马兜铃酸污染的土壤上栽培的生菜、番茄、洋葱都含有马兜铃酸，证实马兜铃酸能够抵抗土壤中微生物的分解作用而存留，转移和富集到食用作物中[47-50]。
含马兜铃酸药材的使用沿革
中国地域辽阔，常因交通阻隔，原药材一时难获，将就用观感相似的本地同名药草替代，久之真伪难辩；虽有识者尽力辩伪订正，但未能全面纠正，后来经药典纳入也就普及了。最明显的就是原古方中主产四川的白木通，近300年来有80%以上为东北产的关木通所取代；粉防己也被两广产的广防己取代。它们在植物分类学中属于完全不同的科、属、种，含有完全不同的化学成分。这种混乱埋下了隐患。现代药理学研究证明白木通利尿，但关木通无此作用[6]。而以关木通代白木通去湿利尿，仅因肾曲小管损伤，尿浓缩困难，尿量有增而被误认为利尿。这是一直以来的错用。
回溯药物的取代衍化，自古就习以为常。《神农本草》中无木通，仅有通草，那是五茄科通脱木(tetrapanax papyriferus)的纸质样茎髓，能吸水，就称能下水、通乳。到唐朝时才有木通科木通(akebia quinata)，与通草并列；到元朝始有毛茛科木通(clematis armendi)，即本草所记载的白木通。在明清之交，马兜铃科木通，即关木通(aristolochia manshuriensis)，由于产量大且价格便宜，遂占主位。名为木通的药材经历了4种不同科、属、种植物的衍变。未见有支持这种替代的明确科学根据。现今所用木通主要为关木通、川木通(aristolochia kaempferi)及淮通(aristolochia moupinensis)。古方中的白木通(akebia triofoliata)已少见，马兜铃科的植物仍占了绝大多数[7]。似此随意取代，实应严加禁止。
关于各种木通的主要化学成分，通草、通脱木含有糖醛酸28%，余为灰分等，并无生物活性成分；木通科木通主要含木通皂甙和豆甾醇、三萜化合物等；毛茛科木通主要含齐墩果酸、常春藤甙元等。以上3种药材均无马兜铃酸成分。市上的防己有数种，属马兜铃科者占多数，都含有马兜铃酸[8]。
就马兜铃酸本身而言，确有辅助消炎和止痛作用，但其潜隐的慢性毒性甚剧[9]，须披沙拣金，仔细筛选。
马兜铃酸的人体代谢[15,20,51]和致病的分子病理学[15]
马兜铃酸被人体吸收后全身分布，在血液中与白蛋白结合，限制了经肾小球的过滤排泄，而主要从肾近曲小管排出。它由有机阳离子转运因子(organic anion transporter) oat1、oat3转运，通过近曲小管上皮细胞（proximal tubular epithelial cell, ptec）的底侧膜进入细胞。然后马兜铃酸代谢产物马兜铃内酰胺（aristololactam, al）与dna结合成为al-dna加合物，由oat4经ptec顶端膜排出，进入肾近曲小管管腔。oat4与马兜铃酸的结合较弱，绝大部分马兜铃酸代谢物滞留在ptec内，可浓缩10~20倍，是马兜铃酸毒作用的组织特异性之关键。
马兜铃酸的代谢有两个方向：一个是还原活化致病；另一个是先氧化再结合，水溶排泄，从而解毒。两方面有竞争关系。氧化酶活力强时还原会减少，一些外源化学物诱导增强细胞色素酶p450(cyp450)时，被还原部分就相对减少，这是一些配伍药（如黄苓，能增强cyp450）减少马兜铃毒性的原理。反之，若配伍剂抑制了细胞色素酶系，则可能加大马兜铃酸毒作用。有关酶系对马兜铃酸具双向作用，既可催化还原又可催化氧化，视微环境氧分压水平等而定。这些酶系又可受染色体畸变、dna突变、基因突变、转录变异、表达程度降低、酶多态、表观遗传失调、外源化合物（包括药物、烟、酒等）的诱导或抑制因素影响，构成人体易感性[20，51]。
动物实验提示，急性肾损伤以ptec坏死为主。但是这种损伤又会从急性期转入慢性期，即使停止或仅间断服用含马兜铃酸药物，病情仍持续发展，直至后来出现肾衰症状，那时再诊断，往往为时已晚，救治乏术。对于此过程只能靠动物实验模型来了解。
马兜铃酸对肾脏的毒性效果 图示对照小鼠和有连续4天aaⅰ暴露小鼠的肾切片，aaⅰ暴露小鼠分别在首次暴露之后5、10、20天被杀死和制作肾切片。图中灰色 指示5和10天后制作切片中的坏死肾小管，有细胞碎片和肾小管管腔；黑色▲指示10和20天后制作切片中的囊性肾小管。从这些图中可见马兜铃酸暴露后肾结构异常的进展。
突变及形成al-dna加合物是促成恶变的重要步骤。它既是马兜铃酸暴露的标记，又是导致病变的始发基础。经马兜铃酸处理的细胞，会产生大量活跃的氧和氮(ros/rns)。氧化应激是马兜铃酸细胞毒性的主要激发事端，使细胞内谷胱甘肽巯基转移酶(gst)减少，细胞周期停止在g2/m相。以抗氧化剂处理细胞会有保护作用，可减少ros和遗传毒性。维持一氧化氮（no）的生物利用度，对于减少产生ros有益。
有学者认为，原始病变可能始于微血管损伤，然后导致肾小管毁损。在动物实验模型中，随着小管周围毛细血管减少，血管内皮生产因子(vegf)表达减少，缺氧诱导因子-1a（hif-1a）表达增加。这提示缺血和低氧是马兜铃酸肾病进展的重要促成因素。肾脏对供氧非常敏感。肾脏的微血管网和内皮细胞的损伤以及促血管物质之间的失衡，会使肾功能降低，ptec坏死。针对炎症和氧化应激反应，补充左旋精氨酸以恢复肾脏的no生物利用度，减弱氧化应激，可保护肾功能，保存肾脏结构。
慢性肾病的最后结果是纤维化。有多条途径能启动和促进纤维化。通过中和抗tgf-β抗体（1d11）抑制p-smad2/3信号通道，可以在马兜铃酸中毒大鼠模型的急性期明显减少急性肾小管坏死和炎症，也减少小管周围毛细血管炎和pdgfr β 细胞形成的肌纤维母细胞积聚，以减缓纤维化[17]。
马兜铃酸引起肾病及肿瘤的病因学争论
把马兜铃酸认定为aan、uuc及rcc的病原，已足可满足判断疾病因果联系的一系列基本准则；而对于马兜铃酸和其他病变如肝癌的因果联系，尚无足够的论据作出评判，还需要进一步的研究[52,53]。尽管马兜铃酸致肾损害的效果是确定的，但发病率低下和一些情况下复制不出动物实验模型这两点，仍是学术上引起争论、临床上悬而未决的问题。
经过马兜铃酸暴露之后，发病的仅为少数人。这是马兜铃类药物在民间医药中长久应用，而其危害性未被及时察觉的重要原因，也是药物去留争执的根源。假如暂且认可易感者为5%~20%，那么对于这些人来说，马兜铃酸是夺命元凶；而对于80%以上的不易感者来说，这是良药。因此，关键在于有效地识别对马兜铃酸毒性的易感者[15,20,51]。
例如地方流行的ben，其发病率一般估计为5%~10%[23]。在最严重的村庄，绝户者约10%[9,19,20,47]。在最早报道的保加利亚弗拉察地区，患病率为6×10-3（1964年）。严重的村子为12.3×10-3；一般为0.7×10-3（1965—1975年）和0.3×10-3（1976—1987年）[54]。克罗地亚布罗德地区的患病率原有11.6%~27.3%（1976—1987年），近已降至0.9%~6.5%（2012年）[55]。布鲁塞尔chn的发病率约128/1 800（7.1%）[9]，平均摄入15个月之后起病。台湾的资料显示，服用过含马兜铃酸物质者5年内（1997—2002年）的肾病（除外高血压、糖尿病、止痛药服用、高地下水砷地区等所致慢性肾病）发病率为14.1%（28 186/199 843）[24]。从台湾资料可大致知道，中国人对马兜铃酸的易感性是不低的。
保加利亚学者在1998年首先提出多因素病因学说[57-59]。易感性是问题的核心，代谢是关键，这是由遗传因素决定的（请注意与遗传决定论不同）。研究的侧重点从此转移到遗传流行病学，并深入到分子遗传学和表观遗传学等方面。兹列举对aan发病有显著影响的若干因素如下。
家族 马兜铃酸仅使部分人发病，患病有家族性。父母双亲都有病者，后代的发病为39.5%；单亲有病者，后代的发病为15.2%；而双亲无病者，后代的发病仅6.5%。这不符合孟德尔遗传定律[9,47,61。发病和不发病的村落及家庭呈嵌花式分布，有的相距仅几米远，或者仅隔一条街道。所以当地说：只有在同一屋檐下生活、同灶吃饭的人，才会一起生病。
细胞遗传 1970年代从保加利亚疫区迁出的移民，后来到新的地方仍有发病。在病人中查到染色体3q25段异常，这段染色体承载的基因主要涉及微血管形成、外源化合物代谢酶、p53基因等。也有学者报道了其他相关染色体片段的畸变[59,60]。
基因突变 最近用外显子测序方法在22 000个基因中鉴别出3个突变基因——cela（胰糜蛋白酶样蛋白酶1基因）、kcnk5(钾离子家族k5基因)和hspg（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2基因）。它们承载与基底膜/细胞外基质和血管张力有关的蛋白质密码，均涉及微血管的形成[61]。
基因转录变异 上海市第一人民医院的研究者研究了马兜铃酸uuc的mrna所发生的29项变化，主要涉及表皮生长因子受体3（egfr3）及akt通道，分别调节表皮细胞生长和肿瘤进展[62]。
蛋白质(酶)表达 酶多态(snp)相关的代谢酶系的实际表达水平，是个体易感性的根源。马兜铃酸在体内的活化或解毒，涉及许多酶系。这些酶系的多态(snp)变异对于表观基因调节以及外源化合物的诱导或抑制都有显著影响。这也是配伍减毒的一个原理，但配伍失当也可能增毒，并不能保证能完全除毒。必须事先查明配伍的交互作用是协同的还是拮抗的，其有效幅度是多少。此外要特别指出，马兜铃酸本身对于代谢它的酶也起诱导作用[20,51]。
表观遗传 保加利亚学者对159名ben患者，用全基因dna芯片做甲基化分析，发现都有寡甲基化异常区。这些很可能就是ben表观基因失调的目标区。具体涉及3个基因——hdac11（承载组蛋白脱乙酰酶iv）、sec61g（其失调涉及异常免疫反应）和ili７ra（过度表达会引起不正常的免疫反应，如肾炎）。ben的分子病理发生过程，为表观基因失调在ben发病中起作用的学说提供了支持[61,63-67]。
作者信息
薛寿征：教授，复旦大学上海医学院，上海200433。
曾广先：主任医师，南京医科大学附属职业病院，南京210029。
xue shouzheng: professor, shanghai medical college, fudan university, shanghai 200433.
zeng guangxian: chief physician, hospital for occupational diseases affiliated to nanjing medical university, nanjing 210029.
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